简略质量研究案例（四）

在整个质量标准的各项检查中，有关物质项占据了大半“江山”，同时，在整个质量研究的分析方法研究过程当中，有关物质项也占据了很大的一部分精力。在快的时间内设计或者选择一个“稳健”的有关物质方法，成为项目完成与否的关键。

对于暂未有药典收载的药物，通常会从整个杂质谱的结构分析开始。对于结构的分析，又要往前翻到本系列的篇简略质量研究案例（一）点击蓝字回看，根据文中所述，去各网站或者数据库中查询并归纳各个杂质的性质，根据性质来选择波长、色谱柱、流动相等。对于波长的选择，在有关物质方法的检查中，与含量中波长的选择依据有差异。对于含量分析方法来说，更关心的是主成分的吸收，而对于有关物质分析来说，更关心的是各个杂质的稳定检出。杂质限度较低，波长选择的差异容易影响到各个杂质的限度。而流动相和固定相（色谱柱）等色谱条件的选择，则会影响到方法的稳健性。一个稳健的分析方法，会让我们的分析方法验证、分析方法转移等工作更加顺畅。一个耐用性较差的方法，不止会在整个研究过程当中虐得我们si去活来，还会影响研究数据的准确性。

当然，对于我们今天所需要讨论的氟哌啶醇有关物质检查项来说，因为已有各国药典收载，故一般还是从药典方法开始进行筛选。

目前，中国药典、美国药典、欧洲药典、英国药典及日本药典均收载了其有关物质检查分析方法，各药典对比如下：

对比四国药典，均采用C18的色谱柱，EP还特别标注了碱去活封尾色谱柱。从本系列的节开始，我们就知道，氟哌啶醇是一个弱碱。在我们接触液相色谱开始，相信绝大多数人都知道，硅胶基质的色谱柱，容易封尾不*而存在一些弱酸性的硅羟基活性位点（Si-OH），这些活性位点会增强对离子化后的碱性化合物的保留而造成拖尾。当然，碱性化合物的拖尾不止这一点，还包括过载引起的拖尾。对于液相色谱拖尾问题，小编在本公众号之前的一个系列中有详细阐述。（奉送直达车：峰型那些事（一））。除中国药典未标注色谱柱规格外，其他三国药典所用的色谱柱从规格上看，柱效基本一致。流动相体系的选择，则是分离策略的选择。

ChP2015所用的磷酸盐缓冲体系，pH刚好在其缓冲范围外，但是，其磷酸盐浓度较常规使用的高（50mmol/L），应该能弥补这一点，另外，ChP2015的供试品浓度并不高（1mg/ml），也弥补了流动相缓冲能力不够的缺点。但从主成分氟哌啶醇来说，再降低一些流动相pH，比如用pH=3.0，可能更加合适。当然，我们一直所说的，单一个组分无所谓方法，对于有关物质来说，更多的考虑是其他组分，而不单单是主成分。对于氟哌啶醇这个项目，小编纯属纸上谈兵，并未深入，而实际当中具体的选择，还是根据具体的工艺来实现。

对于JP17，其选择的缓冲盐体系刚好在柠檬酸盐的缓冲范围内（pKa1=2.1~4.1），但是，其选择的波长（220nm）又超出了柠檬酸盐的截止波长（230nm），超出了截止波长就意味着本底有吸收，可能会影响定量限的浓度水平。另外，JP17还加入了一个小编很不喜欢的离子对-十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS作为阳离子对试剂，一方面可以增加氟哌啶醇的保留，另一方面，则可以改善峰型。但是SDS的使用存在一些缺陷，市售的SDS质量差异非常大，换个品牌或者换个批次，会发生无法重现方法的问题。这是因为市售SDS纯度差异较大的以及组成差异的关系。以SDS为离子对试剂带来的另一方面的困扰是方法耐用性较差，使用的过程当中，必须量取流动相的各组分，确保每次配制的流动相比例一致。否则，微小的缓冲盐-有机相比例差异可能会造成较大的保留时间差异。

USP40\EP9.0\BP2019方法一致，均为缓冲液-乙腈体系。在常规的使用中，四丁基硫酸氢铵在大多数场合均作为离子对试剂出现。但在USP40\EP9.0\BP2019方法中，其并不是作为离子对存在。折算下浓度，其在流动相中的浓度也不低（50mmol/L），一方面，作为增加离子强度的缓冲盐，该浓度下溶液的pH应为2~3。另一方面，更重要的，是作为与待测组分相同的离子组分存在于流动相中，形成离子氛，减少氟哌啶醇与固定相间的相互作用，减少拖尾。四丁基硫酸氢铵作为一个阳离子，也能与固定相中的活性硅羟基作用，同样能从另一方面减少拖尾。由此可见USP40\EP9.0\BP2019在多方面改善了有关物质的峰形问题，过载问题（峰形问题），当然，过载后的峰形较差，峰宽较宽，会影响主峰附近的杂质峰分离，进而影响各杂质的定量限浓度。由于有了上述的一些措施，USP40\EP9.0\BP2019的供试品浓度能使用较高的浓度（10mg/ml），较高的供试品浓度意味着更低的检出限。

稀释剂的选择，氟哌啶醇在分子状态其疏水性并不低，故USP40\EP9.0\BP2019选择了纯甲醇来作为稀释剂。而ChP2015和JP17的流动相均为酸性缓冲液和高比例的有机相，且其供试品浓度较低，用流动相作为稀释剂既方便又可以满足稀释的能力。

相较于ChP2015和JP17的等度，USP40\EP9.0\BP2019的梯度方法现阶段更易被接受。一般认为梯度方法能有更高的区分力和区分范围，较等度方法更科学合理。

至于波长及流速的选择，不同的流动相体系也会影响UV曲线的表现以及组分的保留情况，至于如何选择，跟所需分离的有关物质有关。综合考虑，选择you的组合。

至于供试品浓度及进样量，前述段落中已有所表述。

至于计算方式是选择外标法还是主成分自身对照法，亦或是主成分外标法，还是主成分外标/自身稀释对照外标加校正因子法，取决于产品的特性，从成本角度，方便角度，科学合理角度综合考虑，选择即合理又方便的方式。

限度的考察，条即来自于ICH的限度要求。根据每日大剂量，推算产品的单杂限度。对于药典中已列明的已知杂质，可参照药典标准进行修订。终定入质量标准的杂质并不是越多越好。越多的杂质表明后续测试愈加繁琐，而我们的目标，是在尽量少的操作中，控制风险，使得产品更加安全可靠。

有没有小伙伴要问小编：难道USP40\EP9.0\BP2019就*了吗？USP40\EP9.0\BP2019所使用的四丁基硫酸氢铵会吸附在色谱柱上，可能会使该色谱柱改性而不便于其他产品的使用。另外，四丁基硫酸氢铵的使用，可能会减少色谱柱的寿命。对的，成本的增加也是方法的缺陷哦！~我记得在前述的某篇文章中曾提到，没有的方法，只有适合的方法。

ChP2015及JP17，在限度以及各方面均能满足的情况下，也算一个合适的方法。至于如何挑选，一定是综合各方面的情况后综合选择的。至于方法是否在各方面均能满足，需要通过分析方法学验证来确证。分析方法学验证如何做，且听下回分解！~