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His镍柱标签蛋白纯化,就是这么简单

更新时间:2019-08-12 点击次数:6507

简 介

 

1975年,Porath等人提出了一种新的纯化方法-固定化金属鳌合层析,利用金属离子(Ni2+,Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用,来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。

组氨酸标签由于分子量小,几乎不干扰靶蛋白的功能、活性和结构而被广泛的使用。固定的金属离子亲和层析是纯化组氨酸标签蛋白的常用方法。

 

组氨酸标签蛋白的纯化工具

月旭Ni亲和填料Ni Tanrose 6FF(NTA)

Ni Tanrose 6FF(NTA)亲和介质是将金属离子Ni2+鳌合在以氨三乙酸为配基的6%高度交联的琼脂糖凝胶上形成的亲和层析介质。月旭科技研发的Ni Tanrose 6FF(NTA)不仅纯化纯度较高,通过控制合理的Ni离子密度,结合载量可达到~40mgHis标签蛋白/ml介质,可以用于各种表达来源(如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)的组氨酸标签(6xHis-tagged)蛋白的纯化。NTA含有四个螯合区,较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6xHis可与Ni2+螯合,从而使His标签蛋白结合在Ni Tanrose 6FF(NTA)纯化介质上,未结合的蛋白被洗涤下去,结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液被温和的洗脱下来,从而得到高纯度的目标蛋白。具有载量高、选择性好、易于再生、成本低等优点。有了它,再也不用担心完不成纯化任务了。

PreCot Ni 6FF(NTA)是Ni Tanrose 6FF(NTA)的1ml和5ml预装柱,用来纯化6xHis-tagged蛋白,可以使用注射器、蠕动泵,或者液相层析系统(例如AKTA或FPLC)。

 

Ni Tanrose 6FF(NTA)应用案例

预装柱:PreCot Ni 6FF(NTA) 5ml

样品:含有His标签蛋白(大肠杆菌表达)

平衡液A:50mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20mM咪唑pH8.0

洗脱液B:50mM Tris-HCl,0.5M NaCl,0.5M 咪唑,pH8.0

流速:平衡、洗脱-1.0ml/min上样-0.5ml/min

 

PreCot Ni 6FF(NTA)纯化His标签蛋白的纯化色谱图

 

             1:原液

              2:流穿

              3:洗脱(100%B)

              4:原液

              5:流穿

              6:洗脱(100%B)

 

备注:1-3(样品和平衡液中不含咪唑);4-6(样品和平衡液中含20mM咪唑)

 

由于宿主蛋白中也存在组氨酸和/或半胱氨酸氨基酸残基,其他的非特异性蛋白与靶蛋白一起与金属离子亲和层析填料结合,造成纯化样品纯度不高。提高样品中的咪唑浓度,组氨酸标签蛋白通过Ni Tanrose 6FF(NTA),可以一步纯化得到85%以上纯度的纯化样品。

 

    

 

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