C18固相萃取小柱是一种基于疏水作用原理，键合有十八烷基硅烷的样品前处理装置，广泛用于复杂基质中非极性至中等极性目标化合物的富集与净化。其有效使用依赖于对原理的理解和操作流程的系统性控制，主要包括活化、上样、淋洗、洗脱四个基本步骤，每个步骤均需优化条件以确保目标物的高回收率与良好的净化效果。
一、基本工作原理与流程概述
C18固定相通过长的碳氢链提供疏水性作用力。当含有目标化合物的液体样品通过小柱时，固定相表面的疏水基团与非极性或弱极性目标物发生疏水相互作用，将其保留在柱上。而样品基质中极性较强的干扰物质则随溶剂流出或被弱保留，从而实现目标物的选择性吸附。后续通过更换溶剂，逐步洗去弱保留的干扰物，最后用强洗脱溶剂将目标物解吸下来，完成富集与净化。
标准操作流程依次为：
活化/平衡：用适当溶剂润湿并活化固定相，为吸附创造条件。
上样：使样品溶液以可控流速通过小柱，目标物被保留。
淋洗：使用弱洗脱强度的溶液冲洗小柱，去除部分吸附的干扰杂质。
洗脱：使用强洗脱溶剂将目标物从固定相上解吸下来，收集洗脱液。
后续处理：洗脱液根据需要可进行浓缩、复溶或直接分析。
二、操作步骤详解与优化要点
1、活化与平衡
活化目的：去除柱内可能存在的杂质，并用溶剂润湿固定相表面及键合相，使其从干涸状态转变为可进行疏水作用的溶剂化状态。通常先使用数倍柱床体积的有机溶剂进行润湿。随后，需用与上样溶液性质相近的弱溶剂平衡小柱，以置换掉固定相中过强的有机溶剂环境，防止目标物在后续上样时因保留过弱而穿透。此步骤的溶剂体积需充分，确保固定相润湿与溶剂置换。
2、上样
此步骤是目标物被C18固定相吸附的关键。样品基质应尽可能调整至有利于目标物保留的状态。通常可通过稀释、调节pH值或添加改性剂等方式，降低样品溶剂的洗脱强度，确保目标物能被有效保留。上样流速需控制稳定，流速过快可能导致目标物与固定相作用不充分而部分流失。对于复杂或高基质的样品，较低的流速有助于提高保留与净化效果。
3、淋洗
上样后，淋洗步骤旨在洗去与目标物共吸附的极性或弱保留杂质，而目标物应仍被牢固保留。淋洗溶剂通常具有中等洗脱强度，其组成（水、缓冲液与少量有机溶剂的混合液）和pH值需经优化，以更大化去除干扰物，同时最小化目标物的损失。淋洗溶剂的体积也需优化，以达到足够净化效果而不洗脱目标物。
4、洗脱
此步骤是回收目标物的核心。需选择能有效破坏目标物与C18固定相之间疏水作用的强洗脱溶剂。常用溶剂为高比例的有机溶剂水溶液，或纯有机溶剂。有时需调节pH值以改变目标物形态，促进其洗脱。洗脱溶剂体积需足够，以确保目标物被解吸。可分次加入少量溶剂并收集合并，以提高洗脱效率。洗脱流速不宜过快。
三、关键影响因素与注意事项
样品基质预处理：复杂的生物或环境样品在进入固相萃取前，常需进行离心、过滤、蛋白沉淀等预处理，以防止颗粒物堵塞筛板或大分子物质污染固定相。
溶剂强度控制：理解并控制各步骤所用溶剂的洗脱强度至关重要。应遵循“弱溶剂上样/淋洗，强溶剂洗脱”的原则。溶剂的“强度”顺序需根据目标物和固定相性质判断。
真空压力与流速：使用负压或正压装置时，应调节压力使溶剂以稳定、合适的流速通过小柱，尤其在上样和洗脱步骤中避免流速波动。
防止柱床干涸：在活化后至洗脱完成前，应避免柱床流干，否则会导致填料收缩产生裂隙，使样品溶液或溶剂沿管壁沟流，严重影响保留效率与重现性。
有效使用C18固相萃取小柱，核心在于系统性地优化活化、上样、淋洗、洗脱四个步骤的实验条件。这包括合理选择与调控各步骤溶剂的种类、比例、pH值与体积，精确控制操作流速，并进行适当的样品预处理。通过严谨的方法开发与条件控制，C18小柱能够高效地从复杂基质中分离、纯化与富集目标分析物，为后续的仪器分析提供清洁、浓缩的样品，是提高分析结果准确性与可靠性的关键技术环节。
