尺寸排阻色谱法(SEC)是根据溶液中分子的大小分离化合物的,在柱子的填料中较大的分子会被较细的小孔排除在外。当以有机溶剂作为流动相,使用合成聚合物填料时,SEC就涉及凝胶渗透色谱(GPC)。在以水缓冲液为流动相和使用亲水性柱填料分离生物聚合物(例如蛋白质)时,SEC就称为凝胶过滤色谱。凝胶过滤色谱可作为用以分离生物活性物质(通常等同于在多个纯化步骤中其他的色谱技术)的前处理工具,或者亦可作为获取溶质分子信息的工具,包括分子大小或形状、聚集状态、生物聚合物与其配体结合的动力学参数。
过去凝胶过滤色谱一般采用葡聚糖、琼脂糖或者聚丙烯酰胺等软凝胶作为填料。对于可压缩的填料,必须根据流动相的流速选用适合的重力或者低压泵。软凝胶可以通过交联作用提高稳定性,这样就可以承受更高的流速和几兆帕的压强。凝胶过滤色谱分析时常用的刚性载体是:以亲水性固定相修饰的硅胶基质或者交联的有机聚合物。这些物质能在HPLC系统中使用,其机械强度可以承受几十兆帕或更高的压强。
尺寸排阻色谱法(SEC),顾名思义,它的基本原理就是当目标分析物进入凝胶渗透色谱柱,大体积的分子由于比凝胶颗粒的孔隙大不能进入孔隙,只能在凝胶颗粒之间的空隙流过,最先被淋洗出来;中等体积的分子部分可以进入凝胶颗粒的孔隙,并经颗粒间的空隙流过,淋洗出来的顺序在大体积分子和小分子之间;体积较小的分子比凝胶颗粒的孔隙小,可以进入凝胶颗粒的空隙,并在凝胶颗粒的孔隙以及颗粒之间的空隙不断进入出来扩散,速度最慢,所以是最后被淋洗出来的。当确定仪器型号和实验所需条件后,化合物的淋出体积就与其分子量有关,分子量越大,其淋洗体积越小,具体分离原理如图。
Xtimate® SEC色谱柱是月旭推出的硅胶基质的体积排阻系列色谱柱,其色谱填料为高纯度、具有良好稳定性的硅胶微球表面键合亲水性聚合物。月旭科技采用特殊的表面修饰技术,确保了该填料具有良好的稳定性和批次重现性。
尺寸排阻色谱是根据溶液中分子量大小分离的,其保留时间取决于溶质分子进出固定相孔结构的相对渗透度。然而这个是在理想状态下的分离情况,色谱柱内还存在其他次级作用力,对目标物的分离产生影响。
因此,以Xtimate® SEC色谱柱做方法开发时,需要注意以下几点因素:
为避免色谱柱堵塞,所有样品和溶剂,包括缓冲盐,都必须在使用前用0.45μm或0.22μm滤膜过滤。Xtimate® SEC可以使用水或有机溶剂与水的混合物,与大多数缓冲盐溶液也兼容。流动相使用前需脱气,否则可能出现柱压和基线波动较大。这时可用较大流速冲洗色谱柱2-5min,如对于7.8mm*300mm的色谱柱,可用1.25mL/min的流速。
色谱柱中不可避免会存在其他次级作用力,为了最大限度降低填料与被测物的次级作用力,必须调整流动相的离子强度。NaCl是SEC分离中比较常用的盐,可通过调整离子强度,减少次级作用力,进而改善峰形和分离效果。
流动相的pH调整,更多也是为了减少色谱柱中的次级作用对被测物的影响,所以测定过程中需选择合适的pH。为获得最佳分离效果和延长使用寿命,建议使用pH在2-7.5范围内的流动相。
尽管Xtimate® SEC可在高至3000psi 的压力下使用,但正常的操作压力应当低于1500psi。长时间在高压下运行会损坏色谱柱和输液泵。由于压力来源于流速,因此最大流速将受制于系统所能承受的压力。一般而言,柱压会随着色谱柱使用时间的增加而逐渐增加。
尽量采用低流速测试,可以提高分离度,进而获得更好的测试效果。内径为4.6mm和7.8mm的色谱柱,一般建议其正常操作流速分别为0.1-0.4mL/min和0.1-1.25mL/min。
通过增加色谱柱的长度可以改善SEC分离度,所以在分离过程中,在一根色谱柱达不到分离效果时,可以考虑两根色谱柱串联,甚至不同孔径的色谱柱串联(注:一般大孔径的在前,小孔径的在后)。这种条件下通常也会造成出峰时间延后,及系统压力增加。
最高操作温度为80℃。为了获得最长的使用时间,最佳操作温度为10-30℃。长时间在高温(>80℃)下操作也会损坏色谱柱,这种情形在高的 pH(>7.5)条件下尤其突出。
随着使用次数的增加,某些样品可能吸附到入口筛板或填料上。当积累到一定程度时会出现压力升高,并伴随峰形异常等现象。因此,日常使用过程中需要经常注意对色谱柱进行冲洗和维护,以达到最佳的分离效果和延长使用寿命。