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划重点!液相流动相使用的那些事儿

更新时间:2022-05-17 点击次数:3692

液相色谱是实验室使用频率非常高的仪器设备,在使用过程中会有许多小技巧和注意事项,今天小编就跟大家一起扒一扒流动相使用的那些事儿。

 

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液相色谱示意图

从上图我们可以看出来,流动相在整个液相系统中起着重要的作用,类似我们身体的血液,起着运输的作用,关于流动相那些事儿,我们一起来看看吧。

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1

流动相选择原则(反相体系中)

由强到弱:

一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验,这样可以很快地得到分离结果,然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

三倍规则:

每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量,保留因子约增加3倍,此为三倍规则。这是一个较为省力的办法。调整的过程中,注意观察各个峰的分离情况。

粗调转微调:

当分离达到一定合适的程度,应将有机溶剂10%的改变量调整为5%,并据此规则逐渐降低调整幅度,直至各组分的分离情况理想。

2

流动相的pH值

采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时,通过调节流动相的pH值,以抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸,流动相的pH值越小,组分的K值越大,当pH值远远小于弱酸的pKa值时,弱酸主要以分子形式存在;对弱碱,情况相反。分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。

3

卤代有机溶剂应特别注意的问题

卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质,能与HPLC系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解,不能存放太久。卤代溶剂(如,CCL4、CHCL3等)与各种醚类(如,yi醚、二异丙醚、四氢呋喃等)混合后,可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的产物,这种混合流动相应尽量不采用,或新鲜配制。此外,卤代溶剂(如CH2CL2)与一些反应性有机溶剂(如乙腈)混合静置时,还会产生结晶。总之,卤代溶剂最好新鲜配制使用。如果是和干燥的饱和烷烃混合,则不会产生类似问题。

4

选对滤膜很重要

微孔滤膜的材质(化学兼容性

选择微孔滤膜时,首先要考虑化学兼容性。滤膜是否耐酸、碱、有机溶剂等。几种常见滤膜的特性及应用如下所示:

① 聚醚砜滤膜(PES)

特性:亲水性、高流速、高通量、低蛋白吸附、低溶出物、耐高压灭菌。

应用:一般试剂,样品的实验室过滤;超纯水、食品、饮料等的过滤;血清样品的过滤。

② 醋酸纤维素滤膜(CA)

特性:亲水性、低吸附能力、低非特异性结合能力、热稳定性。

应用:蛋白质和酶过滤;样品前处理过滤中广泛使用的滤膜之一。

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③ 混合纤维素滤膜(MCE)

特性:亲水性、高流速、由硝酸纤维素和醋酸纤维素混合而成。

应用:微生物和颗粒分析;无菌测试。

④ 硝酸纤维素滤膜 (NC)

特性:亲水性、耐弱酸、高蛋白结合能力。

应用:微生物检测与捕获等;微量元素分析等;医学研究及诊断方面的生物工程,生化分析等。

⑤ 聚偏二氟乙烯滤膜(PVDF)

特性:疏水性、高灵敏度、机械强度高、蛋白吸附低、具有良好的耐热性及化学稳定性。

应用:气体及蒸汽过滤, 高温液体过滤,溶剂和化学原料的净化过滤;油类中不溶物的净化;化学物质的分离和提纯。

⑥ 聚四氟乙烯滤膜(PTFE)

特性:疏水性、具有广泛的化学兼容性、耐温性好、抗强酸强碱、化学腐蚀性较强的溶剂及氧化剂。

应用:化工、医药、食品、能源等领域,几乎能过滤所有的有机溶液;强酸和强碱的过滤;高温液体的过滤;特殊化学试剂的过滤;气体的澄清过滤。

⑦ 尼龙滤膜(NY)

特性:亲水性、耐温性能好、强度高、化学稳定性好、耐稀酸稀碱等。

应用:样品的除菌,过滤;工业水的过滤。

聚丙烯滤膜(PP)

特性:耐酸碱、耐磨损、耐冲击、微孔分布均匀、过滤面积大、透水性好。

应用:在药品、饮料、日常用水、废水、空气过滤等方面广泛应用。

滤膜的孔径

具体实验中,应该根据您的过滤目的实验需求来选择合适的孔径的滤膜和滤器。

0.1μm: 能去除样品中的支原体。

0.2μm:可以去除99.99%的细菌微生物,达到GMP或者药典的除菌要求,还可以去除样品、流动相中极细微的颗粒。

0.45μm: 能滤除大多数细菌微生物,对常规样品、流动相等的过滤,能满足一般色谱要求。

0.8μm及以上:可以过滤较大颗粒的杂质或者难处理、浑浊样品的预处理,经预处理后再选择相应滤膜进行过滤。

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注意事项

水相溶液

对于水相溶液来说,首要的问题是防止污染。对于溶剂瓶我们要做的非常重要的工作就是勤换流动相,常换常新,夏天对于纯水或者纯盐流动相可以配置后放入冰箱冷藏,临时用放置至室温。

有机相溶液

对于有机相溶液,可以不用担心细菌繁殖的问题。但是有机相容易发生聚合,特别是乙腈在适宜的光照条件下极易发生聚合,瓶子里就会出现一些絮状的聚合沉淀物。为了防止聚合过程的发生,装乙腈时要用棕色的溶剂瓶,避免阳光直射,更换乙腈时应当弃去瓶底剩余的溶液。

清洗过滤

溶剂瓶里的过滤头,其作用是为了防止溶液瓶中的颗粒杂质进入到仪器的流路系统中,它的材质通常分为玻璃烧结石英或不锈钢,如果不慎堵塞会造成流动相吸液不畅,在管路中造成气泡,需进行清洗,玻璃材质的通常是用稀硝酸泡,而不锈钢材质的可以直接进行超声清洗。

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